FLIM
Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie, TCSPC, Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung, Time-to-Digital Converter, TDC, Time Tagger, Analog-Digital-Converter, ADC, FRET, Förster-Resonanzenergietransfer, Photolumineszenz-Abklingzeit
Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) ist ein bildgebendes Verfahren der modernen Lichtmikroskopie. Anstelle der reinen Fluoreszenzintensität wird für jedes Bildpixel die charakteristische Abklingzeit (Lebensdauer τ) der angeregten Fluorophore ortsaufgelöst bestimmt.
Die Fluoreszenzlebensdauer liegt typischerweise im Bereich von Hunderten Pikosekunden bis zu wenigen Nanosekunden. Da dieser Wert weitgehend unabhängig von der lokalen Farbstoffkonzentration, Photobleaching oder Schwankungen der Laserintensität ist, liefert FLIM robuste quantitative Daten über die mikroskopische Umgebung. Typische Anwendungsfelder sind die Messung von lokalem pH-Wert, Viskosität, Sauerstoffpartialdruck und Ionenkonzentrationen sowie der Nachweis von Proteininteraktionen mittels FLIM-FRET.
Messprinzip und Datenerfassung: In konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen (CLSM) oder Multiphotonenmikroskopen wird die Probe punktweise mit einem hochfrequent gepulsten Laser (z. B. 20 bis 80 MHz) angeregt. Das Fluoreszenzlicht wird mit Einzelphotonendetektoren (z. B. SPADs, PMTs, Hybrid-Detektoren) registriert. Die Erfassung erfolgt primär über zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC):
- Pikosekunden-Timing mit TDCs: Hochauflösende Time-to-Digital-Converter (TDCs wie der xTDC4 oder TimeTagger) messen die exakte Zeitdifferenz zwischen dem Laseranregungspuls und dem Eintreffen des einzelnen Photons mit Pikosekunden-Präzision. Zusätzliche Digitalkanäle erfassen die Taktsignale des Scanners (Pixel-, Line- und Frame-Clock), um jedes detektierte Photon exakt der richtigen Bildkoordinate zuzuordnen.
- ADC-basiertes TCSPC mit schnellen ADCs: Ultra-schnelle Analog-Digital-Wandler tasten das Detektorsignal direkt ab. Durch die Erfassung des vollständigen Pulsverlaufs können digital im FPGA eine Constant-Fraction-Diskriminierung (CFD) zur Beseitigung von Time-Walk, eine Pulshöhenanalyse sowie eine zuverlässige Erkennung von Mehrfachereignissen (Pile-up) durchgeführt werden. Dies ermöglicht höchste Zählraten bei exzellenter zeitlicher Auflösung.
Aus den akkumulierten Zeitstempeln wird pro Bildpunkt ein Zerfallshistogramm berechnet, über Fit-Funktionen die Lebensdauer τ bestimmt und als farbcodiertes 2D- oder 3D-Lebensdauerbild dargestellt.
Beachten Sie auch unsere ausführliche Beschreibung dieser Anwendung.
Funktionsprinzip einer FLIM-Messung: Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) pro Pixel mit schneller TDC-/ADC-Elektronik zur Rekonstruktion von Lebensdauer-Falschfarbenbildern.